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近年來,生物制藥行業(yè)呈現(xiàn)出繁榮發(fā)展的趨勢,很多大分子生物制品已經(jīng)過監(jiān)管部門批準(zhǔn)上市,另有不少創(chuàng)新型大分子正處于臨床后期或上市前申報階段,即將為患者帶來福音。例如,基于CHO細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體、基于大腸桿菌(E.coli)體系表達(dá)的重組蛋白或納米抗體、基于HEK293細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞SF9表達(dá)的腺相關(guān)病毒(AAV)、基于酵母細(xì)胞表達(dá)的病毒樣顆粒(VLP)等。不同于傳統(tǒng)的小分子化學(xué)藥,生物大分子的表達(dá)體系更為復(fù)雜,雜質(zhì)種類更多(如宿主蛋白(HCP)和宿主DNA殘留(HCD)等),雜質(zhì)結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜,這給下游純化帶來了極大的挑戰(zhàn)。
基于傳統(tǒng)微球技術(shù)的層析工藝是生物大分子純化的重要手段,其具有工藝性能穩(wěn)定、放大性良好等優(yōu)點(diǎn)。近年來,多模式層析填料受到越來越多的關(guān)注。多模式層析填料往往具備至少兩種相互作用機(jī)制,其中最常見的是將離子交換模式與疏水相互作用模式結(jié)合,可以在廣泛的pH和電導(dǎo)率范圍內(nèi)有效純化目標(biāo)分子。
圖1. HCPureTM配基結(jié)構(gòu)和作用方式
HCPureTM是英國Astrea Bioseparations公司2023年推出的多模式層析填料,填料基架為粒徑均一的高交聯(lián)瓊脂糖,基架上修飾有化學(xué)合成的小分子配基(圖1),主要以疏水相互作用的方式結(jié)合料液中的雜質(zhì),同時兼具氫鍵相互作用模式(與市售主流產(chǎn)品作用原理不同,形成互補(bǔ)),適用于多種表達(dá)體系,在廣泛的上樣條件下,能穩(wěn)健的去除料液中的HCP(宿主細(xì)胞蛋白)、HCD(宿主細(xì)胞DNA)、聚集體、分子片段等工藝或產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。表1展示了HCPureTM在常見的表達(dá)體系中雜質(zhì)去除能力。
表1. HCPureTM在多種表達(dá)體系中的應(yīng)用效果
1. HCPureTM在大腸桿菌(E. coli )表達(dá)體系中可以有效去除HCP
在該應(yīng)用案例中,研究人員使用大腸桿菌(E. coli )表達(dá)納米抗體Vκ,收獲液先經(jīng)過Protein L親和層析純化,洗脫液經(jīng)中和后調(diào)節(jié)成不同的pH(6.0-8.0)和電導(dǎo)率(6-18mS/cm),隨后以流穿模式上樣HCPureTM,收集流穿液和淋洗液,檢測Vκ和HCP的含量,以探究HCPureTM的最佳上樣條件。測試條件如下表所示:
圖2. E.coli表達(dá)體系中HCPureTM上樣pH和電導(dǎo)率的探究
由圖2的檢測結(jié)果可知,在較低的pH(6.0)和較低的電導(dǎo)率(6ms/cm)上樣條件下,HCP的去除效果最佳,同時目標(biāo)分子Vκ的回收率最高。在最優(yōu)上樣條件下,料液中的HCP可以從30000ppm降至200ppm(2個log值的去除能力),Vκ回收率大于85%(表2)。
表2. HCPureTM在E. coli 表達(dá)體系中可以有效去除HCP
2. HCPureTM在CHO細(xì)胞表達(dá)體系中可以有效去除HCP
在該應(yīng)用案例中,研究人員使用CHO細(xì)胞表達(dá)IgG型單克隆抗體,澄清后的收獲液先經(jīng)過Protein A親和層析純化,洗脫液經(jīng)中和后調(diào)節(jié)成不同的pH(4.0-9.0)和電導(dǎo)率(8-18ms/cm),再以流穿模式上樣到HCPureTM中,收集流穿液和淋洗液,檢測IgG和HCP含量,其中,pH 6.0、電導(dǎo)率12ms/cm是未經(jīng)調(diào)節(jié)的親和層析洗脫中和液。
表3. CHO細(xì)胞體系中,不同上樣pH和電導(dǎo)率條件下,HCPureTM均可有效去除HCP
由表3的檢測結(jié)果可知,在廣泛的上樣pH和電導(dǎo)率范圍內(nèi),HCPureTM均可有效的去除上樣料液中的HCP(平均84%),同時保持目標(biāo)分子的高回收率(平均87%)。此外,由于pH 6.0、電導(dǎo)率12mS/cm是初始的親和層析洗脫中和液,因此,親和層析后,料液可不經(jīng)過調(diào)整或緩沖液置換,直接上樣到HCPureTM中,同樣保持優(yōu)秀的回收率和HCP去除效果,且大大節(jié)約了工藝時間和成本。
3. HCPureTM在CHO細(xì)胞表達(dá)體系中可以有效去除聚集體
在該應(yīng)用案例中,研究人員使用CHO細(xì)胞表達(dá)IgG型單克隆抗體,料液經(jīng)過Protein A親和層析和陽離子交換層析純化后,在較低的pH和較高的電導(dǎo)率條件下孵育,誘導(dǎo)產(chǎn)生高含量的聚集體,再以流穿模式上樣HCPureTM,收集流穿液和淋洗液,檢測聚集體含量。
表4. HCPureTM可顯著去除抗體料液中的聚集體
由檢測結(jié)果(表4)可看出,料液經(jīng)過HCPureTM純化后,聚集體由初始的6.7%降低到2.9%,HCPureTM可顯著去除料液中的聚集體。
4. HCPureTM在HEK 293細(xì)胞表達(dá)體系中可以有效去除HCP
在該應(yīng)用案例中,研究人員使用HEK293細(xì)胞以瞬轉(zhuǎn)的方式表達(dá)2型腺相關(guān)病毒(AAV-2),病毒載體經(jīng)過親和層析純化后,仍含有較高含量的低分子蛋白雜質(zhì),將親和層析洗脫液置換到PBS+200mM NaCl(pH 7.5)中,以流穿模式上樣到HCPureTM(10mm內(nèi)徑層析柱,柱高10cm),總上樣量為5.0E+13VP,收集流穿液和淋洗液進(jìn)行分析。
圖3. SDS-PAGE檢測結(jié)果
表5. ELISA檢測結(jié)果
由SDS-PAGE結(jié)果(圖3)可看出,流穿液中包含大部分病毒衣殼蛋白VP1,VP2和VP3條帶(8-13泳道),而再生液(14泳道)中則包含大量的低分子蛋白雜質(zhì)條帶,表明HCPureTM可以有效去除料液中的蛋白雜質(zhì)分子。由ELISA檢測結(jié)果(表5)可知,流穿液中的病毒衣殼蛋白幾乎全部回收(接近100%),表明HCPureTM在去除蛋白雜質(zhì)的同時可以保持優(yōu)秀的AAV回收率。
HCPureTM多模式層析填料技術(shù)參數(shù)
HCPureTM多模式層析填料產(chǎn)品信息
散裝填料
預(yù)裝柱
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Astrea Bioseparations于1987年孵化自劍橋大學(xué),擁有超過30年層析介質(zhì)研發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗,是世界級層析介質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)供應(yīng)商。目前使用Astrea的產(chǎn)品已有超過21個生產(chǎn)工藝通過了FDA和EMA的批準(zhǔn)。Astrea Bioseparations在全球擁有3個研發(fā)和生產(chǎn)基地,專注為生物大分子和CGT領(lǐng)域提供行業(yè)領(lǐng)先的層析介質(zhì)和技術(shù)服務(wù)。Astrea Bioseparations推出的基于納米纖維的新型層析技術(shù),解決了傳統(tǒng)生物分離工具載量低和工藝耗時問題,實現(xiàn)更快、更環(huán)保、更具成本效益的純化過程,完全符合當(dāng)今生物治療創(chuàng)新的需求。
西美杰是Astrea Bioseparations中國區(qū)代理,為用戶提供完善的技術(shù)支持與售后服務(wù)。歡迎隨時撥打西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網(wǎng)站krono-original.cn了解更多信息。
參考文獻(xiàn):
- J. Kreusser et al., Influence of pH value and salts on the adsorption of lysozyme in mixed-mode chromatography, 2021
- R. Hess et al., Standardized method for mechanistic modeling of multimodal anion exchange chromatography in flow through operation, 2023
- Technical Note: HCPURE?: A FIT FOR PURPOSE HOST CELL PROTEIN CLEARANCE SOLUTION IN E. COLI WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
- Technical Note: HCPure? host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
- Technical Note: HCPure? host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
- Technical Note: HCPURE?: HOST CELL IMPURITY REMOVAL IN CHO WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
- Technical User Guide: HCPureTM, Astrea Bioseparations