一般來講，偶聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗，對于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶標二抗；而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術）中通常使用熒光標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使Biotin/Avidin檢測系統(tǒng)。其中熒光素是具有光致熒光特性的染料，熒光染料種類很多，目前常用于熒光標記二抗的主要有以下幾種：

• 異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)

FITC純品為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm，最大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應用最廣泛的熒光素。由于FITC是小分子化合物，每一個抗體可標記幾個FITC分子，IgM通常用小分子的熒光素標記，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC熒光二抗主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。然而FITC的缺點是淬滅快，因此要和抗淬滅劑一起使用。

• 四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)

這些羅丹明的衍生物耦聯(lián)基團具有不同的吸收波長 (550, 570, 596nm)和最大發(fā)射波長（570, 590, 620nm）。在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記的實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，而且和這兩者覆蓋都很少，氪氬燈激發(fā)光為488nm，598nm和647nm，分別是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激發(fā)波長。因為FITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發(fā), 在流式細胞儀中用FITC作雙標，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯(lián)基團要比羅丹明好。TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定，最大吸收光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現橙紅色熒光，與FITC的綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。因TRITC熒光淬滅慢，也可用于單獨標記染色。

• 菁類染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)

Cy2耦聯(lián)基團激發(fā)波長為492nm，發(fā)光波長為510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定，要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因為這種抗淬滅劑和Cy2反應，在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散。Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團激發(fā)光的最大波長為550nm，最強發(fā)射光為570nm。因為激發(fā)光和發(fā)射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片。Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發(fā)出50％的光強，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標記。Cy5耦聯(lián)基團的激發(fā)波長最大650nm，發(fā)光波長最大670nm。在氪氬燈（647nm）下它們可被激發(fā)出98％的熒光，在氦氖燈下（633nm）為63％。Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中。由于它的最大發(fā)射波長在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時采用具有合適激發(fā)光和遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡，在水相封片劑中應當加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。

• 藻紅蛋白或藻膽色素蛋白-Phycoerythrin(PE)

存在于被稱為藻紅的多聚微粒中，位于葉綠素的反應中心，在自然結構中，藻紅蛋白吸收光能，吸收后轉化成能量，供其發(fā)育生長。當藻紅蛋白被分離和純化后，其蛋白質變得具有很強的熒光，能吸收不同波長的光，發(fā)出亮紅色的熒光，此時不再接受任何外來的光，也不能轉移光能。藻紅蛋白PE的吸收波長范圍較廣，最大的吸收波長為566nm，最大的發(fā)射波長為574nm。藻紅蛋白作為熒光標記物具有以下優(yōu)點：首先具有強的長波長激發(fā)和發(fā)射熒光，可避免來自其他生物材料熒光的干擾；并且具有極高的發(fā)射量子產率；另外PE具有非常高的水溶性而且與許多生物學或合成材料的多位點穩(wěn)定交聯(lián)。

注：由于觀察熒光需要一定波長的激發(fā)光，必須根據實驗室已有的儀器可發(fā)光的波段進行選擇。另外注意多標記中對探針色彩區(qū)分程度的要求，例如，若丹明紅-X (RRX)和德克薩斯紅(TR)熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區(qū)別明顯。如果對靈敏度有更高的要求，則Cy3和Cy5就比其他的熒光團探針要亮。

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