什么是支原體？
支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑 0.2μm)并獨立生活的微生物，沒有細胞壁，表面由胞質膜構成，約有 1%的支原體可通過濾菌器。支原體污染細胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁，多數(shù)情況下細胞病理變化輕微或不顯著。細微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。支原體污染細胞后會影響下游試驗結果。
為什么要重視細胞培養(yǎng)中的支原體污染？
1、污染率高：在細胞研究領域，支原體是臭名昭著的污染源，二十世紀九十年代的支原體污染率是四分之一，而目前有仍然有超過十分之一的基因表達研究（許多曾發(fā)表在頂尖雜志上），表現(xiàn)出支原體污染的跡象；
2、影響日趨嚴重：雖然支原體污染并不一定意味著研究結果無效，但它會影響數(shù)百個基因的表達，并與細胞競爭營養(yǎng)阻礙細胞的生長。在目前測試的一組受污染的數(shù)據(jù)中（淋巴瘤細胞），已經(jīng)鑒定出 61 個被支原體改變的基因，干擾了實驗結果。這無疑是對時間，資源，經(jīng)費很大的浪費；
3、難察覺：支原體污染完全是不留痕跡的，污染后的細胞生長速率一般并未發(fā)生顯著的影響，無法用肉眼識別，除非采用專門的支原體檢測方法檢測；
4、污染源多：“草率操作”、細胞系流通的交叉污染、操作人員自身都是很重要的污染源；
5、難去除：支原體體積小，無細胞壁，約有 1%的支原體可通過過濾器，且一般抗生素根本無法有效抑制或者去除支原體，另外，部分抗生素使用后會對細胞產(chǎn)生敏感效果，從而影響細胞的狀態(tài)；
6、重視程度日益增加：學術雜志發(fā)表實驗結果需驗證支原體污染影響，在國際上，支原體污染檢測已經(jīng)日益成為細胞培養(yǎng)污染常規(guī)檢測之一，同時也是有效規(guī)避支原體污染的重要方法之一。
世界性難題?。。?！Nature 収布癿文獻表明細胞研究領域中存在嚴重的支原體污染問題
Ewen Callaway. Contamination hits cell work. Nature, 29 July 2014; doi:10.1038/511518a
如何保護細胞細胞不受支原體的污染？
西美杰代理的德國 PanReac Applichem 所提供 Myco 系列支原體清除產(chǎn)品可以直接整合到質膜上破壞支原體的完整性，從而有效地清除支原體污染，而且沒有細胞毒性。另有支原體檢測與預防系列產(chǎn)品可以給細胞提供更多的安全保護。
一、AppliChem 支原體清除系列
對于普通細胞系，遭受污染以后可以通過重新復蘇，購買等途徑更換樣本，但是對于一些較難獲得的珍貴樣本，如干細胞，原代細胞，經(jīng)過特殊處理的，或訂購困難的細胞，一旦遭受支原體污染后，一定要馬上進行處理。AppliChem研發(fā)的支原體清除的 Myco 系列產(chǎn)品，可以直接整合到質膜上破壞支原體的完整性，從而有效的清除支原體污染，并可以針對不同程度，不同細胞樣本進行針對性處理，處理過程簡單，對細胞不會造成任何副作用。
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名稱 |
主要成分 |
適用樣本 |
使用斱法 |
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Myco-3 （貨號 A5240） |
環(huán)丙沙星 |
貼壁細胞，可清除大多數(shù)支原體污染 |
100 倍稀釋加入培養(yǎng)基，每 2-3 天換液，連續(xù)處理14天 |
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Myco-1 （貨號 A5222） |
泰妙菌素 |
貼壁細胞，配合能解決頑固型支原體或者使用 Myco-3 處理停用后又出現(xiàn)支原體污染的情況 |
100 倍稀釋加入培養(yǎng)基，與 Myco-2 配合使用。使用 Myco-1 處理 4 天后換 Myco-2 處理 3 天，如此重復 2-3 次即可 |
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Myco-2 （貨號 A5233） |
二甲胺四環(huán)素 |
二、AppliChem 細胞污染預防系列
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名稱 |
適用環(huán)境 |
預防微生物 |
使用斱法 |
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Incubator-Clean （貨號 A5230） |
CO2 培養(yǎng)箱， 工作等臺等 |
支原體，真菌及芽孢、細菌、病毒（包拪 HIV，HBV 等） |
即用型，噴霧處理完全濕潤即可，無需轉移出細胞，建議每 2 周處理一次 |
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Incuwater-Clean （貨號 A5219） |
C02 培養(yǎng)箱水盤 |
支原體，真菌及芽孢、細菌、病 毒（包拪 HIV，HBV 等） |
100 倍稀釋加入水盤滅菌水中，建議每 2-4 周更換滅菌水 |
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Aquabator-Clean （貨號 A9390） |
水浴鍋 |
細菌，真菌 |
100 倍稀釋加入水浴鍋，建議每 1-2 周吐水浴鍋加入一次，每 4-6 周給水浴鍋更換一次水 |
三、Applichem 支原體檢測系列
傳統(tǒng)的支原體檢測方法包括支原體分離培養(yǎng)、支原體特異酶檢測、DNA 熒光染色檢測以及 PCR 檢測，除 PCR 檢測方法以外，其他檢測方法大多耗時長，要求檢測人員具有豐富的經(jīng)驗，并且無法獲得足夠的靈敏度和特異性，對于一些稀有的支原體亞種無法有效檢測。
AppliChem 設計的支原體檢測試劑盒系列產(chǎn)品均是基于 PCR 方法，根據(jù)支原體 16S rRNA 保守序列設計引物，經(jīng)過 PCR 反應擴增其 16S rRNA 片段，后采用瓊脂糖電泳方法檢測 270bp 條帶。相對傳統(tǒng)方法而言，具有強大優(yōu)勢：
- 高靈敏度：敏感度高達 100~1000CFU/ml，僅需 要 0.5 - 1.0 ml 細胞上清樣本即可檢測；
- 檢測品種廣泛：可檢測常規(guī)品種，同時對于稀有 亞 種 也 能 同 效 檢 測 ， 如 M. pneumoniae, Acholeplasma laidlawii, M. synoviae, M. pulmonis,M.bovis，幾乎覆蓋自然界 80 余個品種；
- 快速：操作時間只需 30 分鐘，全程 5 個小時內 即可得到檢測結果；
- 可靠：試劑盒中包括有陽性對照 DNA，可保證 實驗結果的可重復性，減小因操作帶來的誤差；
- 安全性：無支原體培養(yǎng)過程，有效避免污染擴大。
產(chǎn)品型號
檢測方法
適用儀器
試劑盒組分
PCR
Mycoplasma Test Kit
（貨號 A3744）
普通 PCR-電泳檢測
普通 PCR 儀器
Reaction Mix Buffer Solution
Positive Template Control
qPCR Mycoplasma Test Kit
（貨號 A9019）
熒光定量 PCR
LightCycler®1.2, 1.5, 2.0, 480, Rotor-Gene? 3000, 6000,
ABI Prism® 7000, iCycler iQ®, iQ?5, Opticon 2, Chromo 4, MX300P®, MX4000®.
Primer/Probe/Nucleotide Mix(RED) Rehydration
Buffer(BLUE)
Positive Control DNA(GREEN) Internal Control
DNA(YELLOW) PCR Grade Water(WHITE)
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